1. Allgemeines zur Elektronenmikroskopie
Die Elektronenmikroskopie ist eine sehr wichtige Methode zur Untersuchung
biologischer Strukturen. Zur Abbildung werden elektrische und magnetische
Felder als "Linsen" benutzt. Analog zum Lichtmikroskop gilt für eine
elektrostatische Linse das Brechungsgesetz.
Bewegen sich Elektronen im Magnetfeld, so wirkt auf sie die Lorentz
- Kraft
F = e * v * B
senkrecht zur Bewegungs- und Magnetfeldrichtung. Anders als im elektrischen Feld wird hier nur die Richtung, nicht der Betrag der Geschwindigkeit beeinflußt. Lokal inhomogene Magnetfelder werden in der Elektronenmikroskopie als Linsen verwendet.
Je nachdem, wie das Objekt mit Elektronen bestrahlt wird, unterscheidet
man Durchstrahlungsmikroskope und Reflexionsmikroskope. Bei der Transmissionsmikroskopie
müssen die Objekte sehr dünn sein (max. 100 nm), da Elektronen
in Materie sehr stark gestreut werden. Die Auflösungsgrenze liegt
bei ca. 0.38 nm, immerhin um etwa 10³ besser als mit dem Lichtmikroskop
und in der Größenordnung atomarer Abstände.
Abbildung 1: Funktionsprinzip eines Durchstrahlungs-Elektronenmikroskops.
Rechts zu Vergleich ein Lichtmikroskop.
Beim Rasterelektronenmikroskop wird die speziell behandelte Oberfläche
mit einem feinen Elektronenstrahl abgetastet und die gestreuten Elektronen
werden detektiert. Diese Methode ist besonders gut zur hochauflösenden
Betrachtung von Oberflächen geeignet.
2. Aufbau und Funktion eines Transmissionselektronenmikroskop
Das Präparat wird beim Elektronenmikroskop einem Elektronenstrahl im Gegensatz zum Lichtmikroskop, bei dem das sichtbare Licht die Auflösung auf 0,2 µm limitiert, ausgesetzt. Bei der Elektronenmikroskopie kann durch die geringe Wellenlänge der Elektronen im Vergleich zum sichtbaren Licht eine viel größere Auflösung erreicht werden. Der theoretisch erreichbare Wert liegt bei 10 -12m, in der Praxis werden aber aufgrund von Linsenfehlern nur 10 –10m erreicht.
In einer Röhre in der ein Vakuum erzeugt wird, dient eine Wolframkathode als Elektronenquelle. Durch Anlegen einer Spannung die zwischen 60 und 3000 kV liegen kann, werden die Elektronen in Richtung Anode beschleunigt. Der Elektronenstrahl wird durch magnetische Linsen (Kondensorspule) auf das Präparat gelenkt.
Beim Auftreffen der Elektronen auf das Präparat kann es zu folgenden Wechselwirkungen kommen:
1. Das Elektron durchdringt die Probe ungehindert.
2. Das Elektron wird durch einen positiven geladenen Kern abgelenkt
verliert dabei aber keine Energie (elastische Streuung).
3. Das Elektron trifft auf ein Elektron in einer Kernhülle und
verliert dabei Energie. Das getroffene Elektron wird aus der Elektronenschale
geschlagen und beim Zurückkehren in die Schale wird die überschüssige
Energie in Form von Röntgenstrahlung abgegeben (inelastische Streuung).
Die inelastische Streuung ist wichtig für die Materialanalytik (EEL und EDX). Für die Abbildung mit dem TEM ist aber die elastische Streuung wichtig. Die zur Bildentstehung verwendeten elastisch gestreuten Elektronen sind somit Primärelektronen. Diese werden durch eine weitere magnetische Spule (Objektivlinse) auf die Bildebene projiziert, auf der sie ein fluoreszierendes Abbild des Präparats erzeugen.
Eine wichtige Vorraussetzung für ein gutes Abbildung des Präparats ist, dass die Präparatschnitte sehr dünn sind. Wenn diese zu dick sind wird die Kontrastentstehung verschlechtert. Hierbei sind die Fixierung und Präparation der Schnitte von besonderer Bedeutung.
3. Präparationsmethoden für das TEM
Frische Gewebeproben eignen sich aufgrund ihres relativ hohen Wassergehalts nicht für die Untersuchung in einem Hochvakuum, da sie die Prozedur nicht ohne Veränderung überstehen würden. Ebenso lassen sie sich wegen ihrer weichen Konsistenz nicht in ultradünne Schnitte schneiden. Damit das Gewebe diese Eingriffe ohne morphologische Veränderung übersteht wird es einer Fixierung unterworfen.
Methoden der Fixierung:
1. Kryofixation:
Das Präparat wird schockgefroren. Dabei bleibt der natürliche
Zustand der Zelle erhalten. Diese Methode eignet sich gut zur Beobachtung
von schnell ablaufenden Prozessen oder für Präparate bei denen
der Wassergehalt erhalten bleiben sollte.
2. Chemische Fixation:
Das Präparat wir in Glutaralaldehyd oder Formaldehyd fixiert.
Mit einem Phosphatpuffer wird das Fixiermittel abgewaschen. Anschließend
wird mit Osmiumtetroxid nachfixiert. Auch dieses Fixiermittel wird mit
einem Phosphatpuffer abgewaschen. Im Anschluß daran erfolgt eine
aufsteigende Alkoholreihe. Das Präparat wird mit Uranylacetat
kontrastiert. Die endgültige Einbettung wird mit reinem Kunstharz
durchgeführt.
Die Dünnschnitte werden mit dem Ultramikrotom hergestellt. Zuvor wird das Kunstharzblöckchen mit einer Rasierklinge grob zugeschnitten. Mit einem Glasmesser wird die Schneidefläche nivelliert. Die Ultradünnschnitte werden mit einem Diamantmesser hergestellt. Hinter dem Messer befindet sich ein mit Wasser gefüllter Trog auf dem die Schnitte durch die Oberflächenspannung schwimmen. Die Schnittdicke kann anhand der Lichtbrechung bestimmt werden. Unter Verwendung einer Wimper werden die Schnitte auf ein Netzchen übertragen.
Im Anschluß daran erfolgt das Trocknen und die Beschichtung mit Kontrastmittel. Dann kann der Schnitt im TEM angeschaut werden.
4. Beispiele für TEM - Abbildungen
Abbildung 2 : Chlamydomonas spec. ( Alge ), 12 000 fache Vergrößerung
Abbildung 3 : Desmosomen der menschlichen Haut, 40 000 fache
Vergrößerung
Abbildung 4 : Kryopräparation von Saccharomyces cerevisiae, 16 000 fache Vergrößerung