Molekulare Methoden zur Erythrozytenserologie

Day 1
1. Pipette 40 ml buffer no. 1 in a 50 ml plastic tube (e.g. Falcon).
2. Add 5 ml whole blood or buffy coat. 
3. Incubate for 30 min at room temperature in a lying position. 
4. Centrifugate at 3,000 x g for 10 min. 
5. Remove the supernatant by decantation. 
6. Resuspend the pellet in the residual fluid by vortexing. 
7a. Add 15 ml of buffer no. 1.
7b. Transfer into a 15 ml plastic tube.
8. Centrifugate at 3,000 x g for 10 min. 
9. Remove the supernatant by suction. 
10. Resuspend the pellet by vortexing. 
11. Add 5 ml buffer no. 2, 1 ml 10% SDS and 1 ml Proteinase K, working solution.
12. Mix carefully and incubate the sample overnight in a waterbath at 37°C. 

Day 2
13a. As a result of efficient digestion the tube contains a gelatinous lysate.
13b. If not: Add more Proteinase K and incubate 2-3 h at 56°C. 
14. Equilibrate at room temperature (important!). 
15. Add 1 ml 5 M NaCl and mix vigorously for 15 sec. 
16. Centrifugate at 3,800 x g for 15 min. 
17a. Remove any foam.
17b. Transfer residual supernatant into a new 15 ml plastic tube (Falcon).
17c. Discard the sediment.
18. Centrifugate at 3,800 x g for 15 min. 
19. Transfer the supernatant into a new 15 ml plastic tube. 
20a. Add 5 ml of 100% ethanol and mix carefully (don't shake!).
20b. A white fluffy precipitate (DNA) appears. 
21. Transfer the white precipitate with a glass Pasteur-pipette into 70% ethanol and wash briefly (dip the precipitate several times).
22. Put the white precipitate immediately into a tube with 1 ml Aqua dest. 
23. Rotate the tube for 30 min at room temperature to dissolve the white precipitata (DNA). 
24. Store DNA at -20°C.

1. Tag
1. 40 ml Puffer Nr. 1 in 50 ml Plastik-Röhrchen geben (z. B. Falcon).
2. 5 ml EDTA-Blut zugeben.
3. 30 min bei Raumtemperatur liegend inkubieren. 
4. 10 min bei 3.000 x g zentrifugieren. 
5. Überstand abschütten. 
6. Sediment vom Boden des Röhrchens lösen (z. B. mit Rüttler). 
7a. 15 ml Puffer Nr. 1 zugeben.
7b. In 15 ml Plastik-Röhrchen überführen.
8. 10 min bei 3.000 x g zentrifugieren. 
9. Überstand absaugen. 
10. Verbliebener Bodensatz mit Rüttler lösen. 
11. 5 ml Puffer Nr. 2, 1 ml 10% SDS-Lösung und 1 ml Proteinase K, Arbeitslösung zugeben. 
12. Vorsichtig schwenken und über Nacht im Wasserbad bei 37°C inkubieren. 

2. Tag
13a. Eine visköse Flüssigkeit ohne Klumpen zeigt den vollständigen Verdau an.
13b. Falls nicht: nochmals Proteinase K zufügen und 2-3 h bei 56°C inkubieren.
14. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen (wichtig!) 
15. 1 ml 5 M NaCl dazugeben und 15 Sekunden kräftig schütteln. 
16. 15 min bei 3.800 x g zentrifugieren. 
17a. Schaum mit Pipette absaugen.
17b. Überstand in ein neues 15 ml Plastik-Röhrchen (Falcon) überführen.
17c. Sediment verwerfen. 
18. 15 min bei 3.800 x g zentrifugieren. 
19. Überstand in ein neues 15 ml Plastik-Röhrchen überführen. 
20a. 5 ml 100% Äthanol zugeben und vorsichtig schwenken (nicht schütteln!).
20b. Es bildet sich ein Faden (DNA). 
21. Faden mit Pasteurpipette abheben, in 70% Ethanol überführen und kurz schwenken.
22. Faden in 1 ml Aqua dest. in einem Einfrierröhrchen lösen. 
23. Röhrchen 30 min bei Raumtemperatur langsam rotieren lassen, um Faden (DNA) aufzulösen. 
24. DNA bei -20°C einfrieren. 

Erythrocyte lysis buffer, 10x stock solution
207.28 g NH₄Cl 
19.78 g NH₄HCO₃
0.925 g EDTA
add Aqua dest. to total volume of 2.5 liters 

Erythrocyte lysis buffer, working solution 
buffer no. 1
add 900 ml Aqua dest. to 100 ml 10x stock solution 

Leukocyte lysis buffer 
buffer no. 2
2.44 g Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethane 
46.72 g NaCl 
1.488 g EDTA 
add Aqua dest. to a total volume of 2 liters
adjust to pH 8.2 using about 5 to 10 drops 10 M NaOH 

10% SDS
100 g Sodium-dodecyl-sulfate 
be careful, do not inhale
dissolve in 1 l Aqua dest. 

Proteinase K, 10x stock solution
500 mg Proteinase K 
(Boehringer Mannheim, No. 1 000 144)
be careful, use gloves
dissolve in 50 ml Aqua dest. (= 10 mg/ml)
aliquot at 1 ml and keep as frozen stock at -20°C

Proteinase K, working solution
add 9 ml Aqua dest. to 1 ml 10x stock solution (= 1 mg/ml)
keep at +4°C

5 M NaCl
292,2 g NaCl
add Aqua dest. to a total volume of 1 liter

Erythrozytenlyse-Puffer, 10fach Stammlösung
207,28 g NH₄Cl 
19,78 g NH₄HCO₃
0,925 g EDTA
Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 l zugeben 

Erythrozytenlyse-Puffer, Arbeitslösung
Puffer Nr. 1
900 ml Aqua dest. zu 100 ml 10fach Stammlösung zugeben 

Leukozytenlyse-Puffer 
Puffer Nr. 2
2,44 g Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan 
46,72 g NaCl 
1,48 g EDTA 
Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 2 l zugeben
auf pH 8,2 einstellen mit ca. 5 bis 10 Tropfen 10 M NaOH 

10% SDS-Lösung
100 g Natriumlaurylsulfat (SDS)
Vorsicht, nicht Einatmen
in 1 l Aqua dest. lösen 

Proteinase K, 10fach Stammlösung
500 mg Proteinase K 
(Boehringer Mannheim, Nr. 1 000 144)
Vorsicht, Handschuhe benutzen
in 50 ml Aqua dest lösen (= 10 mg/ml)
in 1 ml Portionen bei -20°C lagern

Proteinase K, Arbeitslösung
9 ml Aqua dest. zu 1 ml 10fach Stammlösung zugeben (= 1 mg/ml)
bei +4°C lagern

5 M NaCl
292,2 g NaCl
Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l zugeben

Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988 Feb 11;16(3):1215