Methoden zur Erythrozytenserologie

Freezing
1. Fill 1 vol packed RBC (EDTA-blood, washing not required) into freezing tube (with screw cap).
2. Add 1 to 2 vol glycerol solution.
3. Mix well (tilt several times, no vortexing).
4. Freeze slowly at -80°C without vibration (put box in -80°C freezer for 1 day).
5. For long term storage, transfer into liquid nitrogen barrel.

Thawing
1. Fill about 500 microliter sorbitol solution into freezing tube with frozen RBC.
2. Thaw slowly on ice (higher temperatures up to 37°C are possible, but reduce RBC recovery considerably).
3. Immediately after thawing, drop RBC into a new tube containing at least 2 ml sorbitol solution (transfer carefully, no pipetting).
4. Let sit for 30 min at room temperature.
5. Centrifuge slowly, do not resuspend sediment.
6. Wash several times with NaCl 0.9%-solution, until supernatant is not hemolytic anymore. Do not resuspend sediment.
7. Then, resuspend sediment and wash once more.

Einfrieren
1. 1 Teil gepackte Erythrozyten (EDTA-Blut, ungewaschen) in Tieffriergefäss (mit Schraubverschluss).
2. 1 bis 2 Teile Glyzerinlösung zugeben.
3. Gut mischen (mehrmaliges Umkippen, kein Rüttler).
4. Bei -80°C langsam, erschütterungsfrei einfrieren (in Pappschachtel für 1 Tag in -80°C Truhe stellen).
5. Für längere Lagerung (mehr als 3 Monate) in Fass mit Flüssigstickstoff überführen.

Auftauen
1. Ca. 500 Mikroliter Sorbitlösung in das Tieffriergefäss mit den gefrorenen Erythrozyten zugeben.
2. Auf Eis langsam auftauen (höhere Temperaturen bis 37°C sind zum Auftauen möglich, führen aber zu erheblichem Verlust an Erythrozyten).
3. Sofort nach dem Auftauen, Erythrozyten in neues Gefäß mit mindestens 2 ml Sorbitlösung kippen (vorsichtig überführen, keine Pipette verwenden).
4. 30 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
5. Langsam zentrifugieren, Sediment nicht aufschütteln.
6. Mehrmals mit NaCl 0,9%-Lösung waschen, bis Überstand nicht mehr hämolytisch. Dabei Sediment nicht aufschütteln.
7. Zum Schluss Sediment aufschütteln und noch 1 Mal waschen.

Glycerol solution (2 liters)
12.6 g NaCl
58.0 g D-sorbitol (sorbit, C6H14O6, MW 182,18)
760.0 g glycerol (38% glycerin, C3H8O3, MW 92.09)

add chemicals to 1 l Aqua dest., mix until dissolved
add Aqua dest. to total volume of 2 liters
0.1% NaN3 may be added

add chemicals to 1 l Aqua dest., mix until dissolved
add Aqua dest. to total volume of 2 liters
0.1% NaN3 may be added