Metabolic engineering“ zur Steigerung und Optimierung der L-Valin- und L-Lysinproduktion mit Corynebacterium glutamicum
- Dr. rer. nat. Bastian Blombach
In Zeiten schwindender Ölreserven und damit stetig steigender Rohölpreise wächst die Nachfrage nach kostengünstigen biotechnologischen Applikationen auf der Basis von nachwachsenden Rohstoffen. Diese auf Nachhaltigkeit ausgerichteten industriellen Produktionsprozesse werden heute unter dem Namen der „Weißen Biotechnologie“ zusammengefasst und verlangen die effiziente und ökonomische Umsetzung von nachwachsenden Rohstoffen in gewünschte Produkte. Das Produktspektrum der Weißen Biotechnologie reicht von organischen Säuren (z. B Bernsteinsäure, Milchsäure), Biokraftstoffen (z. B. Ethanol, Butanol) über Vitamine und Antibiotika bis zu den Aminosäuren (z. B. L-Glutamat, L-Lysin). Aminosäuren finden unter anderem im Lebensmittel- und Tierfutterbereich wie auch in der Medizin Verwendung und sie werden zum überwiegenden Teil mit Corynebacterium glutamicum oder Escherichia coli in großtechnischen Fermentationsanlagen produziert. Da jedoch die Produkterträge und die Produktivitäten noch unter den theoretisch zu erwartenden Werten liegen und die weltweite Nachfrage nach Aminosäuren stetig wächst, gibt es ein fortwährendes Interesse an der Weiterentwicklung und Optimierung von Produktionsstämmen für die biotechnologische Aminosäureproduktion.
Herr Dr. Bastian Blombach vom Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie hat in seiner Dissertation den Stoffwechsel von C. glutamicum bei der Produktion der Aminosäuren L-Valin und L-Lysin analysiert und dann mit Hilfe des sogenannten „metabolic engineering“, d. h. der gezielten Veränderung des Stoffwechsels, C. glutamicum-Produktionsstämme für die Aminosäuren L-Valin und L-Lysin konstruiert und optimiert.
Der erste Teil der Arbeit von Herrn Dr. Blombach befasst sich mit der Verbesserung der L-Lysinproduktion mit C. glutamicum. Durch Inaktivierung des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDHKs) und damit der Inaktivierung des Kohlenstoffflusses in den Zitronensäure-Zyklus in C. glutamicum DM1729 konnte die Lysinproduktion dieses Modellstammes um 40% gesteigert werden. Die anschließende Abschwächung bzw. Inaktivierung der Acetylhydroxysäure-Synthase, welche eine Vorstufe der L-Lysinbiosynthese zu unerwünschten Nebenprodukten umsetzt, verbesserte die L-Lysinproduktion von C. glutamicum DM1729 um mehr als 100%.
Im zweiten Teil seiner Arbeit hat Herr Dr. Blombach die Bedeutung der Vorstufenbereitstellung für die L-Valinbiosynthese und -produktion untersucht und aufbauend auf den gewonnenen Erkenntnissen sukzessive immer bessere L-Valinproduzenten von C. glutamicum konstruiert. Das Ausgangsexperiment war wiederum die Inaktivierung des PDHKs im Wildtyp von C. glutamicum. Die Charakterisierung der Mutante ergab, dass sie zum Ende der Wachstumsphase Pyruvat und L-Alanin und zusätzlich erhebliche Mengen an L-Valin ausschied. Da L-Valin aus zwei Molekülen Pyruvat gebildet wird, lag es nahe, dass der positive Effekt des PDHKs auf der besseren Verfügbarkeit von Pyruvat in der Mutante zurückzuführen ist. Diese Hypothese konnte durch die Bestimmung der intrazellulären Pyruvatkonzentration im Wildtyp und in der PDHK-negativen Mutante untermauert werden. Herr Dr. Blombach hat dann untersucht, ob und inwieweit sich das Einbringen und die Überexpression von Genen für L-Valin-Biosynthese-Enzyme positiv auf die L-Valinproduktion auswirkt. Hier konnte er zeigen, dass die Überexpression der Gene für drei L-Valinbiosynthese-spezifische Enzyme für die L-Valinproduktion sehr vorteilhaft ist und gleichzeitig die Bildung unerwünschter Nebenprodukte reduziert. In weiteren Experimenten schaltete Herr Dr. Blombach die Gene für drei Zentralstoffwechsel-Enzyme (Pyruvat:Chinon-Oxidoreduktase, Phosphoglucose-Isomerase und Pyruvat-Carboxylase) aus und konnte in einem iterativen Vorgehen sukzessive zu Produzenten-Stämmen kommen, die mehr als 400 mM L-Valin mit einem Ertrag von 0,75 Mol pro Mol Glucose bildeten. Die durchgeführten Schritte zur Veränderung des Zentralstoffwechsels betrafen zum einen die bessere Vorstufenbereitstellung (Pyruvat) und zusätzlich die Versorgung mit Reduktionsäquivalenten (NADPH). Nach den zur Zeit veröffentlichten Daten sowie nach zugänglichen Patenten und Patentanmeldungen stellen die von Herrn Dr. Blombach konstruierten Stämme bezüglich Substrat-spezifischer Ausbeute und Produktivität zur Zeit die besten L-Valinproduzenten dar.
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