Red Blood Cell related methods
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Molekulare Methoden zur Erythrozytenserologie

The Rhesus Site
DNA isolation

Day 1
1. Pipette 40 ml buffer no. 1 in a 50 ml plastic tube (e.g. Falcon).
2. Add 5 ml whole blood or buffy coat. 
3. Incubate for 30 min at room temperature in a lying position. 
4. Centrifugate at 3,000 x g for 10 min. 
5. Remove the supernatant by decantation. 
6. Resuspend the pellet in the residual fluid by vortexing. 
7a. Add 15 ml of buffer no. 1.
7b. Transfer into a 15 ml plastic tube.
8. Centrifugate at 3,000 x g for 10 min. 
9. Remove the supernatant by suction. 
10. Resuspend the pellet by vortexing. 
11. Add 5 ml buffer no. 2, 1 ml 10% SDS and 1 ml Proteinase K, working solution.
12. Mix carefully and incubate the sample overnight in a waterbath at 37°C. 

Day 2
13a. As a result of efficient digestion the tube contains a gelatinous lysate.
13b. If not: Add more Proteinase K and incubate 2-3 h at 56°C. 
14. Equilibrate at room temperature (important!). 
15. Add 1 ml 5 M NaCl and mix vigorously for 15 sec. 
16. Centrifugate at 3,800 x g for 15 min. 
17a. Remove any foam.
17b. Transfer residual supernatant into a new 15 ml plastic tube (Falcon).
17c. Discard the sediment.
18. Centrifugate at 3,800 x g for 15 min. 
19. Transfer the supernatant into a new 15 ml plastic tube. 
20a. Add 5 ml of 100% ethanol and mix carefully (don't shake!).
20b. A white fluffy precipitate (DNA) appears. 
21. Transfer the white precipitate with a glass Pasteur-pipette into 70% ethanol and wash briefly (dip the precipitate several times).
22. Put the white precipitate immediately into a tube with 1 ml Aqua dest. 
23. Rotate the tube for 30 min at room temperature to dissolve the white precipitata (DNA). 
24. Store DNA at -20°C.


1. Tag
1. 40 ml Puffer Nr. 1 in 50 ml Plastik-Röhrchen geben (z. B. Falcon).
2. 5 ml EDTA-Blut zugeben.
3. 30 min bei Raumtemperatur liegend inkubieren. 
4. 10 min bei 3.000 x g zentrifugieren. 
5. Überstand abschütten. 
6. Sediment vom Boden des Röhrchens lösen (z. B. mit Rüttler). 
7a. 15 ml Puffer Nr. 1 zugeben.
7b. In 15 ml Plastik-Röhrchen überführen.
8. 10 min bei 3.000 x g zentrifugieren. 
9. Überstand absaugen. 
10. Verbliebener Bodensatz mit Rüttler lösen. 
11. 5 ml Puffer Nr. 2, 1 ml 10% SDS-Lösung und 1 ml Proteinase K, Arbeitslösung zugeben. 
12. Vorsichtig schwenken und über Nacht im Wasserbad bei 37°C inkubieren. 

2. Tag
13a. Eine visköse Flüssigkeit ohne Klumpen zeigt den vollständigen Verdau an.
13b. Falls nicht: nochmals Proteinase K zufügen und 2-3 h bei 56°C inkubieren.
14. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen (wichtig!) 
15. 1 ml 5 M NaCl dazugeben und 15 Sekunden kräftig schütteln. 
16. 15 min bei 3.800 x g zentrifugieren. 
17a. Schaum mit Pipette absaugen.
17b. Überstand in ein neues 15 ml Plastik-Röhrchen (Falcon) überführen.
17c. Sediment verwerfen. 
18. 15 min bei 3.800 x g zentrifugieren. 
19. Überstand in ein neues 15 ml Plastik-Röhrchen überführen. 
20a. 5 ml 100% Äthanol zugeben und vorsichtig schwenken (nicht schütteln!).
20b. Es bildet sich ein Faden (DNA). 
21. Faden mit Pasteurpipette abheben, in 70% Ethanol überführen und kurz schwenken.
22. Faden in 1 ml Aqua dest. in einem Einfrierröhrchen lösen. 
23. Röhrchen 30 min bei Raumtemperatur langsam rotieren lassen, um Faden (DNA) aufzulösen. 
24. DNA bei -20°C einfrieren. 

  • anticoagulated blood like:
  • EDTA-anticoagulated whole blood or
  • citrate-anticoagulated buffy coat.
  • Do not use heparin for anticoagulation.
  • Material
  • Antikoaguliertes Blut wie zum Beispiel
  • EDTA-antikoaguliertes Vollblut oder
  • Zitrat-antikoagulierter "Buffy coat" einer Vollblutspende.
  • Kein Heparin zur Antikoagulation verwenden.
  • Reagents

    Erythrocyte lysis buffer, 10x stock solution
    207.28 g NH4Cl 
    19.78 g NH4HCO3
    0.925 g EDTA
    add Aqua dest. to total volume of 2.5 liters 

    Erythrocyte lysis buffer, working solution 
    buffer no. 1
    add 900 ml Aqua dest. to 100 ml 10x stock solution 

    Leukocyte lysis buffer 
    buffer no. 2
    2.44 g Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethane 
    46.72 g NaCl 
    1.488 g EDTA 
    add Aqua dest. to a total volume of 2 liters
    adjust to pH 8.2 using about 5 to 10 drops 10 M NaOH 

    10% SDS
    100 g Sodium-dodecyl-sulfate 
    be careful, do not inhale
    dissolve in 1 l Aqua dest. 

    Proteinase K, 10x stock solution
    500 mg Proteinase K 
    (Boehringer Mannheim, No. 1 000 144)
    be careful, use gloves
    dissolve in 50 ml Aqua dest. (= 10 mg/ml)
    aliquot at 1 ml and keep as frozen stock at -20°C

    Proteinase K, working solution
    add 9 ml Aqua dest. to 1 ml 10x stock solution (= 1 mg/ml)
    keep at +4°C

    5 M NaCl
    292,2 g NaCl
    add Aqua dest. to a total volume of 1 liter


    Erythrozytenlyse-Puffer, 10fach Stammlösung
    207,28 g NH4Cl 
    19,78 g NH4HCO3
    0,925 g EDTA
    Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 l zugeben 

    Erythrozytenlyse-Puffer, Arbeitslösung
    Puffer Nr. 1
    900 ml Aqua dest. zu 100 ml 10fach Stammlösung zugeben 

    Puffer Nr. 2
    2,44 g Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan 
    46,72 g NaCl 
    1,48 g EDTA 
    Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 2 l zugeben
    auf pH 8,2 einstellen mit ca. 5 bis 10 Tropfen 10 M NaOH 

    10% SDS-Lösung
    100 g Natriumlaurylsulfat (SDS)
    Vorsicht, nicht Einatmen
    in 1 l Aqua dest. lösen 

    Proteinase K, 10fach Stammlösung
    500 mg Proteinase K 
    (Boehringer Mannheim, Nr. 1 000 144)
    Vorsicht, Handschuhe benutzen
    in 50 ml Aqua dest lösen (= 10 mg/ml)
    in 1 ml Portionen bei -20°C lagern

    Proteinase K, Arbeitslösung
    9 ml Aqua dest. zu 1 ml 10fach Stammlösung zugeben (= 1 mg/ml)
    bei +4°C lagern

    5 M NaCl
    292,2 g NaCl
    Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1 l zugeben

    If using the method provided herein, please give reference to the "The Rhesus Site" and the following literature:

    Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988 Feb 11;16(3):1215

    Homepage Abteilung Blutgruppenserologie und Immunhämatologie, DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg, Institut Ulm 
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