Methode

Die Bestimmung der Glucose verläuft nach folgenden Schritten:

1. Pipettieren Sie 700 µl Tris-HCl Puffer pH 7,5 in die Glasküvette oder in ein Eppendorfreaktionsgefäß.
2. Geben Sie 150 µl glucosehaltige Lösung hinzu.
3. Geben Sie 50 µl Magnesium-Stammlösung hinzu.
4. Geben Sie 50 µl ATP-Stammlösung hinzu.
5. Geben Sie 50 µl NADP-Stammlösung hinzu.
6. Starten Sie die Reaktion durch 10 µl Enzymlösung Hexokinase/Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase (3,4 U Hexokinase bei 25°C und 1,7 U Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase bei 25°C).
7. Inkubieren Sie die Ansätze für 15 Minuten bei 37°C im Heizblock oder im Wasserbad.
8. Pipettieren Sie die Ansätze in eine Quarzglasküvette.
9. Messen Sie die Extinktion bei 365 nm. Protokollieren Sie Ihre Messwerte in einer Tabelle.
10. Berechnen Sie die Glucosekonzentration.

Tabelle 1: Pipettierschema für eine einfache Glucosebestimmung
	Probe 1	Probe 2	Probe 3
Tris-HCl	700 µl	700 µl	700 µl
Glucose-Stammlösung	0 µl	50 µl	150 µl
Wasser	150 µl	100 µl	0 µl
Mg2+	50 µl	50 µl	50 µl
ATP	50 µl	50 µl	50 µl
NADP	50 µl	50 µl	50 µl
Enzyme	10 µl	10 µl	10 µl

Variationen:

• Testen Sie die Ansätze bei Raumtemperatur und bei 45°C.
• Ersetzen Sie bei der Glucose-Messung die Zugabe des Mg2+ durch reines Wasser.
• Ersetzen Sie bei der Glucose-Messung das NADP durch die gleiche Menge NAD.
• Testen Sie anstelle von Glucose auch jeweils 2 mM Stammlösungen von Mannose, Lactose, Galaktose, Fructose und Saccharose.
• Geben Sie zu den Fructose-Ansätzen auch 2 U Glucose-6-Phosphat Isomerase hinzu.
• Geben Sie in einen Ansatz, der 50 µl 2 mM Glucose und 100 µl 2 mM Fructose enthält, zunächst Hexokinase/Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase hinzu. Geben Sie nach dem Auslaufen der NADPH-Bildung 2 U Glucose-6-Phosphat Isomerase hinzu.

Eine alternative Glucose-Bestimmung gibt es hier.