Funktionelle Analyse von Schlüsselkomponenten

Zur funktionalen Analyse von regulatorischen Schlüsselkomponenten, die durch systembiologische Modellierung identifiziert wurden, werden Tiermodelle eingesetzt. Die Forschungsgruppen von SyStaR haben Zugang zu genomweiten lentiviralen shRNA-Bibliotheken von Maus und Mensch (OpenBiosystems). shRNA-Technologie wird für die Analyse regulatorischer Schlüsselkomponenten in Stammzellen sowie zur Untersuchung der Auswirkungen von Gen-Knockdowns in hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) bei der Transplantation in vivo eingesetzt. Die Arbeitspakete A-D werden zur Identifikation von zentralen Genen und Signalwegen führen, die altersabhängige Veränderungen in spezifischen oder übergreifenden Zell- und Gewebskompartimenten zeigen. Ob die identifizierten Gene und Signalwege einen funktionellen Einfluss auf die Stammzellfunktion und den Gewebeerhalt haben, soll im Rahmen des hier beschriebenen Arbeitspaketes untersucht werden.

Das Arbeitspaket unterteilt sich in 2 Unterpakete:

  • E.a. Analyse der Funktion von altersabhängig dysregulierten Hauptsignalwegen auf den Erhalt funktionsfähiger Stammzellen
  • E.b Analyse der Funktion von altersabhängig dysregulierten Hauptsignalwegen auf Gewebshomeostase und Regeneration

 

E.a. Analyse der Funktion von altersabhängig dysregulierten Hauptsignalwegen auf den Erhalt funktionsfähiger Stammzellen

Hierbei werden lentivirale shRNA-Konstrukte zum Knockdown von Targetgenen (aus den Expressionsanalysen und den bioinformatischen Analsyen) kloniert. Die Versuche erfolgen zunächst im gepoolten Ansatz der Hauptkandidaten-Gene. Hierzu werden die Haupttargetgene zur Herstellung von Target-shRNA Bibliotheken verwendet und in die entsprechenden Stammzellpopulationen infiziert (lentiviral). Die Positiv- od Negativ-Selektion von shRNA Konstrukten wird mittels Deep-Sequencing in Kurzzeitkulturen von primären Stammzellpopulationen oder im Transplantationsexperiment bestimmt.

E.b Analyse der Funktion von altersabhängig dysregulierten Hauptsignalwegen auf Gewebshomeostase und Regeneration

Analog zu den funktionellen Versuchen von regulatorischen Genen im Rahmen der Stammzellalterung werden in diesem Teil des Arbeitsprogramms funktionelle Untersuchungen von regulatorischen Genen in regenerativen Geweben in vivo vorgenommen (in Leber, Darm, und Haut). Die Untersuchungen konzentrieren sich auf identifizierte Hauptregulatoren, die eine altersabhängige Expressionsänderung in den genannten Geweben im Rahmen der Alterung zeigen. Die Untersuchungen erfolgen zum Einen in genetisch veränderten Modellorganismen (Drosophila, Zebrafisch). Darüberhinaus werden Mausgewebe in vivo mit Expressionskonstrukten (shRNAs oder cDNAs) von Hauptkandidatengenen transduziert und Auswirkungen auf den Gewebeerhalt im Rahmen der Alterung untersucht.

Beteiligte Arbeitsgruppen

Folgende Arbeitsgruppen sind an diesem Arbeitspaket beteiligt:

  • Alexander Kleger / Thomas Seufferlein (Gastroenterologie)
  • Albert Ludolph (Neurologie)
  • Michael Denkinger (Geriatrie)
  • Karin Scharffetter-Kochanek (Dermatologie)
  • Hubert Schrezenmeier (Transfusionsmedizin)
  • Hartmut Geiger (Dermatologie)
  • Michael Kühl (Biochemie)
  • Nils Johnsson (Zellbiologie)
  • Franz Oswald (Gastroenterologie)
  • Petra Pandur (Biochemie)
  • Lenhard Rudolph (Kooperationsgruppe Fritz-Lipmann-Institut)
  • Thomas Wirth (Phsiologische Chemie)