FOXO - Transkriptionsfaktoren bei hämatopoetischen Tumoren

v.l. Dr. Franziska Gehringer, Dr. Franz Ketzer, Anita Kick, Dr. Alexey Ushmorov

Forschungsinteressen

B-Zell-Lymphome und akute lymphoblastische B-Zell-Leukämien (B-ALL) sind bösartige Erkrankungen, die von B-Zellen in verschiedenen Stadien ihrer Differenzierung ausgehen. B-Zell-Lymphome und B-ALL gehören zu den häufigsten hämatologischen Neoplasien. Die B-ALL hat eine relativ gute Prognose, wenn sie mit intensiver Chemotherapie nach den aktuellen Protokollen behandelt wird (bei 80-90% der Kinder kann eine Langzeitremission erreicht werden). Leider liegt die Heilungsrate nach einem Rückfall bei weniger als 40%. Darüber hinaus verursacht eine intensive Chemotherapie oft schwere, manchmal lebensbedrohliche akute und langfristige Nebenwirkungen. Im Vergleich zu pädiatrischen Patienten sind die Heilungsraten für Erwachsene, die an B-ALL leiden, nach wie vor schlecht. Nur 30-40 % von ihnen erreichen eine langfristige Remission. Ein beeindruckender Fortschritt wurde auch bei der Behandlung von B-Zell-Lymphomen erzielt, aber, wie im Fall der B-ALL, erfordern die primäre und erworbene Resistenz gegen Chemotherapie und die schweren Nebenwirkungen der intensiven Behandlungsprotokolle die Suche nach neuen effizienteren und weniger toxischen Therapiemodalitäten. Wir konzentrieren uns darauf, die für das B-Zell-Differenzierungsstadium spezifischen Proliferations- und Überlebensprogramme anzugreifen, die von den meisten B-Zell-Malignomen aufrechterhalten werden.

Seit 2010 untersuchen wir die Rolle der FOXO-Transkriptionsfaktoren bei der Pathogenese von B-Zell-Neoplasien. FOXOs gehören zur FOX O-Familie der Transkriptionsfaktoren, die alle eine hochkonservierte „Forkhead“-DNA-Bindungsdomäne aufweisen, sich aber in der Struktur der Transaktivierungsdomänen unterscheiden, was ihre teilweise nicht-redundanten Funktionen erklärt. Zu den zellulären Funktionen von FOXOs gehören die Regulierung des Zelltods, der Zellproliferation, der Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies, die Reaktion auf DNA-Schäden und der Zellstoffwechsel (einschließlich Lipogenese und Glukoneogenese). Obwohl die Mitglieder der FOXO-Familie in allen Geweben exprimiert werden, gibt es einen offensichtlichen quantitativen Unterschied in ihrer Gewebeverteilung. Insbesondere FOXO1 ist in B-Zellen stark exprimiert. FOXO1 ist essentiell für das Überleben und die Differenzierung von B-Zellen in frühen Stadien der B-Zell-Entwicklung sowie für die Keimzentrumreaktion, die für die Affinitätsreifung des B-Zell-Rezeptors verantwortlich ist.

FOXO1-Repression trägt zur Blockade der Plasmazelldifferenzierung beim klassischen Hodgkin-Lymphom (cHL) bei

Im Jahr 2012 (Xie L. et al., Blood, 2012) konzentrierten wir uns auf die niedrige FOXO1 Expression im cHL im Vergleich zu normalen B-Zellen und Non-Hodgkin-B-Zell-Lymphomen (NHL). cHL ist ein B-Zell-Lymphom, das sein B-Zell-Programm größtenteils verloren hat. Wir haben gezeigt, dass eine Überexpression von FOXO1 in cHL-Zelllinien Apoptose induziert und sind zu dem Schluss gekommen, dass FOXO1 ein Tumorsuppressor im cHL ist. Zuletzt untersuchten wir die molekularen Auswirkungen der FOXO1-Überexpression im cHL mit Hilfe von Genexpressionsprofilen. Wir identifizierten den Hauptregulator der Plasmazelldifferenzierung, PRDM1, als transkriptionelles Ziel von FOXO1, das dessen Tumorsuppressorfunktion vermittelt. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die tumorsuppressive Wirkung von PRDM1 von einer Herunterregulierung des Proto-Onkogens MYC abhängt (Abb. 1). Außerdem nahmen wir an, dass eine niedrige FOXO1-Expression für den charakteristischen Phänotyp der "abortiven Plasmazelldifferenzierung" von Hodgkin- und Reed-Sternberg-Zellen, der malignen Komponente des cHLs, verantwortlich ist.

Abb. 1. FOXO1 repression contributes to the block of plasma cell differentiation in classical Hodgkin lymphoma (Vogel MJ et al. Blood 2014).

Feinregulierung von FOXO3A im cHL als Überlebensmechanismus und Kennzeichen einer fehlgeschlagenen Plasmazelldifferenzierung

Bei der weiteren Untersuchung der Rolle von FOXO1 in B-Zell-Lymphomen konzentrierten wir uns auf den reziproken Charakter der FOXO1- und FOXO3A-mRNA-Expression im Prozess der B-Zell-Differenzierung von den Keimzentrumszellen der dunklen Zone (DZ) zu den Plasmazellen (PZ). Die Expressionslevel von FOXO1 nahmen im Verlauf der terminalen Differenzierung von der DZ B-Zelle zur PZ ab, während die FOXO1-mRNA-Spiegel anstiegen. Wir stellten fest, dass die FOXO3A-mRNA-Werte im cHL höher waren als in DZ B-Zellen, aber niedriger als in PZ. Außerdem zeigten wir, dass diese intermediären FOXO3A-Expressionsspiegel für das Überleben des cHLs essentiell sind, da entweder eine Erhöhung oder Senkung der FOXO3A-Menge unangemessen war (Abb. 2).

Wir kamen folglich zu dem Schluss, dass cHL-Zellen jene FOXO3A/FOXO1 Expressionsniveaus aufrechterhalten, die den Differenzierungsstatus der normalen Vorläuferzelle des cHLs widerspiegeln, und dass die Aufrechterhaltung des Proliferations- und Überlebensprogramms dieser normalen Vorläuferzelle für das Überleben des cHLs wesentlich ist. Auf diese Weise postulierten wir ein ‚Goldilocks‘-Prinzip für die FOXO-Effekte im B-Zell-Lymphom.

Abb. 2. Fine-tuning of FOXO3A in cHL as a survival mechanism and a hallmark of abortive plasma cell differentiation (Osswald CD, et al., 2018)

Eine strenge Regulierung von FOXO1 ist für die Aufrechterhaltung der B-ALL unerlässlich

Auf der Suche nach Unterstützung unserer ‚Goldilocks‘-Hypothese fanden wir heraus, dass die B-ALL, die sehr empfindlich auf FOXO-aktivierende Behandlungen (z.B. Inhibitoren von AKT oder Überexpression von FOXO1) reagiert, eine hohe FOXO1-Expression in den Kernen aufrechterhält, was auf eine Rolle von FOXO1 bei der B-ALL hinweist. Wir haben gezeigt, dass die genetische Inhibierung von FOXO1 einen Wachstumsstopp und Apoptose in B-ALL-Zelllinien induziert (Abb. 3). Vor allem aber zeigte die pharmakologische Hemmung von FOXO1 eine Anti-Leukämie-Aktivität in mehreren primären pädiatrischen ‚patient-derived-xenograft‘-Proben mit einer effektiven Leukämie-Reduktion in den hämatopoetischen, lymphoiden und zentralnervösen Organkompartimenten. Dies führte letztlich zu einem verlängerten Überleben ohne erneutes Auftreten von Leukämie in einem präklinischen in-vivo-Modell der B-ALL. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Repression von FOXO1 ein möglicher Ansatz für die Behandlung von B-ALL sein könnte.

Abb. 3. Tight regulation of FOXO1 is essential for maintenance of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (Fan W. et al., Blood, 2018).

Im Burkitt-Lymphom (BL) fördert Proliferations- und Überlebensprogramm der dunklen Zone des Keimzentrums und kann als pharmakologisches Target dienen

Bei der erneuten Analyse unserer alten Daten zur FOXO1-Expression in B-Zell-NHL-Subtypen konnten wir eine hohe FOXO1-Expression in Kernen des BLs feststellen. Mit Hilfe von „loss of function“-Experimenten identifizierten wir einen antiproliferativen Effekt des FOXO1-Knockdowns in BL-Zelllinien, welcher mit der Unterdrückung des B-Zell-Programms der DZ einschließlich der Expression von MYB, CCND3, RAG2, BACH2 und CXCR4, einherging. Darüber hinaus wurde die Induktion von Signalwegen der hellen Zone wie NF-κB und PI3K-AKT beobachtet. Mithilfe eines „rescue“-Experiments identifizierten wir die Herunterregulierung des Proto-Onkogens MYB als einen kritischen Faktor, der zur antiproliferativen Wirkung des FOXO1-Knockdowns beiträgt. In einem Versuch die Umsetzbarkeit der pharmakologischen FOXO1-Repression zu beurteilen, fanden wir heraus, dass der niedermolekulare FOXO1-Inhibitor AS1842856 in BL-Zelllinien bei niedrigen Konzentrationen Zelltod und Wachstumsstopp induzierte. Wie im cHL und der B-ALL beobachteten wir auch bei den BL-Zelllinien, dass eine Überaktivierung von FOXO1 ebenfalls eine Wachstumshemmung induzierte, was auf die Bedeutung einer strikten Regulation der FOXO1-Aktivität im BL hinweist (Abb. 4).

Abb. 4. FOXO1 confers maintenance of the dark zone proliferation and survival program and can be pharmacologically targeted in Burkitt lymphoma (Gehringer F., et al., Cancers, 2019).

Eine physiologische PTEN-PI3K-AKT Aktivität ist für die Erhaltung des BLs erforderlich

Bei der Untersuchung der Rolle von FOXO1 im Überlebens- und Proliferationsprogramm des BLs befassten wir uns auch mit dem scheinbaren Paradoxon der überwiegend nuklearen FOXO1-Expression und der angeblich hohen Aktivität des FOXO-inaktivierenden PI3K-PDPK1-AKT-Signalwegs im BL. Wir fanden heraus, dass die PI3K-PDPK1-AKT-Aktivität die physiologischen Werte nicht überschreitet, die für die B-Zellen des Keimzentrums, von denen das BL abstammt, typisch sind. Sowohl die Überexpression der konstitutiv aktiven Version von AKT (myrAKT) als auch der Knockdown des natürlichen PI3K-AKT-Signalinhibitors PTEN führten zur Inaktivierung von FOXO1 und unterdrückten das DZ-Proliferations- und Überlebensprogramm und damit das Wachstum des BLs (Abb. 5).

Abb. 5. Physiological levels of the PTEN-PI3K-AKT axis activity are required for maintenance of Burkitt lymphoma (Gehringer F., et al., Leukemia, 2020).

Unsere wichtigsten Ergebnisse

1. Eine klare Klassifizierung der FOXO-Transkriptionsfaktoren und deren regulatorischen Signalwege als "Tumorsuppressoren" und "Onkogene" in B-Zell-Neoplasien ist nicht möglich.

2. In bestimmten B-Zell-Leukämien und -Lymphomen werden die FOXO-Aktivitäten in einer "just right" ‚Goldliocks‘-Zone aufrechterhalten.

3. Eine selektive pharmakologische Modulation der FOXO-Aktivitäten könnte für die Behandlung von B-Zell-Leukämien und Lymphomen genutzt werden.

CCND3 ist essentiell für die Aufrechterhaltung von B-Zell akut lymphoblastischer Leukämie

Im Rahmen einer früheren Publikation (Wang F. et al., 2018) konnten wir zeigen, dass die Inaktivierung von FOXO1 bei B-ALL zu Wachstumsstillstand und Apoptose führt, was teilweise durch die anschließende Reduktion der CCND3 Expression vermittelt wird. Da bisher davon ausgegangen wurde, dass CCND2, kanonisch von MYC aktiviert, die wichtigste Rolle aller D-Cycline bei der Proliferation von B-ALL spielt, führten wir weitere Untersuchungen zur Verbindung zwischen FOXO1 und CCND3 bei B-ALL durch (Ketzer et al. 2022). In dieser Studie konnten wir zeigen, dass CCND3 unabhängig vom Mutationshintergrund für die Proliferation und die Aufrechterhaltung von B-ALL wesentlich ist. Die Expression von CCND3 war dabei in allen B-ALL Subtypen stärker als die von CCND1 und CCND2. Darüber hinaus identifizierten wir die direkte transkriptionelle Aktivierung von CCND3 durch FOXO1. Durch den Vergleich der Auswirkungen von CCND3-Depletion und CDK4/6-Inhibition durch Palbociclib auf B-ALL-Zellen mit verschiedenen Treibermutationen konnten wir feststellen, dass die anti-apoptotische Wirkung von CCND3 unabhängig von der Kinaseaktivität des CCND3-CDK4/6-Komplexes ist. Des Weiteren stellten wir fest, dass eine erhöhte CCND3-Expression mit der Entwicklung einer Resistenz gegen Palbociclib verbunden ist. Schließlich stellten wir fest, dass CCND3 alleine, aber nicht im Komplex mit CDK4/6 zur Transkription von CDK8 beiträgt. Dies erklärt zum Teil die anti-apoptotische Wirkung von CCND3, da wir darüber hinaus zeigen konnten, dass CDK8 essentiell für B-ALL verschiedenen Ursprungs ist. Wir kamen zu dem Schluss, dass CCND3 eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung von B-ALL spielt, unabhängig von der zugrunde liegenden Treibermutation. Darüber hinaus könnte die Herunterregulierung der CCND3-Expression der Hemmung der CDK4/6-Kinase-Aktivität in Bezug auf die Behandlung von B-ALL überlegen sein

Anti-apoptotische Mechanismen von CCND3 in B-ALL (Ketzer et al. 2022)

Kooperationen

Peter Möller and Frank Leithäuser, Institut für Pathologie, Universität Ulm

Randy Gascoyne and Christian Steidl. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Centre for Lymphoid Cancers and the Centre for Translational and Applied Genomics, Vancouver, Canada

Reuben Tooze, Section of Experimental Haematology, Leeds Institute of Cancer and Pathology, University of Leeds, Leeds, UK

Hassan Jumaa, Institut für Immunologie, Universitätsklinikum Ulm

Markus Müschen, Center of Molecular and Cellular Oncology, Yale School
of Medicine

Aktuelle Publikationen

CCND3 is indispensable for the maintenance of B-cell acute lymphoblastic leukemia
Ketzer F, Abdelrasoul H, Vogel M, Marienfeld R, Müschen M, Jumaa H, Wirth T, Ushmorov A.
Oncogenesis. 2022 Jan 10;11(1):1.doi: 10.1038/s41389-021-00377-0.

Hyperstable SGK1 steps out of AKT’s shadow
Gehringer, F., & Ushmorov, A.
Blood.2021 Sep 16;138(11):917-918.doi: 10.1182/blood.2021012518

Physiological levels of the PTEN-PI3K-AKT axis activity are required for maintenance of Burkitt lymphoma.
Gehringer F, Weissinger SE, Möller P, Wirth T, Ushmorov A.
Leukemia. 2019 Nov 12. doi: 10.1038/s41375-019-0628-0.

FOXO1 Confers Maintenance of the Dark Zone Proliferation and Survival Program and Can Be Pharmacologically Targeted in Burkitt Lymphoma.
Gehringer F, Weissinger SE, Swier LJ, Möller P, Wirth T, Ushmorov A.
Cancers (Basel). 2019 Sep 25;11(10). pii: E1427. doi: 10.3390/cancers11101427.

FOXO in B-cell lymphopoiesis and B cell neoplasia.
Ushmorov A, Wirth T.
Semin Cancer Biol. 2018 Jun;50:132-141.

Tight regulation of FOXO1 is essential for maintenance of B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.
Wang F, Demir S, Gehringer F, Osswald CD, Seyfried F, Enzenmüller S, Eckhoff SM, Maier T, Holzmann K, Debatin KM, Wirth T, Meyer LH, Ushmorov A.
Blood. 2018 Apr 5. pii: blood-2017-10-813576. doi: 10.1182/blood-2017-10-813576. 

Fine-tuning of FOXO3A in cHL as a survival mechanism and a hallmark of abortive plasma cell differentiation.
Osswald CD, Xie L, Guan H, Herrmann F, Pick SM, Vogel MJ, Gehringer F, Chan FC, Steidl C, Wirth T, Ushmorov A.
Blood. 2018 Apr 5;131(14):1556-1567. doi: 10.1182/blood-2017-07-795278.

Activation of oncogenic pathways in classical Hodgkin lymphoma by decitabine: A rationale for combination with small molecular weight inhibitors.
Swerev TM, Wirth T, Ushmorov A.
Int J Oncol. 2017 Feb;50(2)

FOXO in B-cell lymphopoiesis and B cell neoplasia.
Ushmorov A, Wirth T.
Semin Cancer Biol. 2017 Jul 31. 

 

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